做CRISPR,用这个工具会让你事半功倍![新品推荐]

【字体: 时间:2016年04月15日 来源:联川生物

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  CRISPR-Cas9特异性取决于前20 bp的sgRNA,因而存在一定的脱靶效应。所以开展CRISPR研究,需要合成相当数量的sgRNAs。如果采用传统方式合成大量sgRNAs,不仅合成费用高,而且合成效率低??蒲腥嗽奔毙杈酶咝У拇蠊婺:铣晒押塑账嵝蛄形目獾姆桨?,帮助他们更便利地开展CRISPR工作。

CRISPR改变游戏规则的技术

1987年,一个日本研究小组在研究大肠杆菌时发现其K12碱性磷酸酶序列附近有成簇的短间隔重复序列。当时研究人员并不清楚这些序列的生物学意义。

然而,三十年后的今天,这个不起眼的“小发现”却绽放出了耀眼光芒,因为科学家们正是利用这个小片段找到了一种可以对多种生物的基因组进行遗传改造的工具,特别的是,这种方法操作起来非常地简单。这个简便又实用的基因组改造新技术称为CRISPR-Cas系统。


 
图1 CRISPR原理

成簇的规律间隔的短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat sequences),即CRISPR序列,这就是日本科学家当年发现的那个序列。研究发现,这些CRISPR序列与很多病毒或者质粒的DNA序列是互补的,说明这套CRISPR-Cas系统很有可能是生物体抵御病毒等外来入侵者的一套特异性防御机制,就好像是另外一套适应性免疫反应系统。

自2013年起,CRISPR的相关研究呈爆发式增长,人们开始将CRISPR应用于各个领域,如构建特定突变基因的模式生物,对某些遗传性致病突变进行修饰,甚至是最近大热的Car-T技术等。CRISPR-Cas9是目前应用最广的基因编辑系统之一,这套系统仅含有一个Cas9蛋白和一段20 bp的single guide RNA(sgRNA),sgRNA用于识别目的序列,Cas9指导前体crRNA(CRISPR RNAs)的成熟、外源DNA降解和质粒降解。crRNA通过碱基配对与trans-activating RNA(tracrRNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物。此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA,造成DNA双链断裂,引起体内细胞修复机制:插入缺失(InDel)引起的非同源末端连接(non-homologous end joining)与同源重组(homologous recombination)修复机制。

CRISPR-Cas9特异性取决于前20 bp的sgRNA,因而存在一定的脱靶效应。所以开展CRISPR研究,需要合成相当数量的sgRNAs。如果采用传统方式合成大量sgRNAs,不仅合成费用高,而且合成效率低??蒲腥嗽奔毙杈酶咝У拇蠊婺:铣晒押塑账嵝蛄形目獾姆桨?,帮助他们更便利地开展CRISPR工作。

OligoMix®为大规模寡核苷酸文库合成而生
 

联川首席科学家高晓连教授是世界上最早提出采用超大规模合成技术(原位合成基因芯片技术)进行人工基因合成概念的科学家?;诖烁拍?,2004年高晓连教授与哈佛大学George Church合作的光化学原位合成基因芯片进行快速合成有活性的基因的研究成果已发表在国际顶尖期刊《Nature》上。

OligoMix®是为满足研究人员使用混合寡核苷酸(pooled oligonucleotides)进行多种不同应用而研发的产品?;诹ň哂凶灾髦恫ǖ?micro;Paraflo®微流体芯片平台,可以一次性平行地合成数千条不同序列组成的寡核苷酸,寡核苷酸合成采用标准的DMT化学法,保证了寡核苷酸的高产量和高质量。据测算,OligoMix®可以比传统碱基合成技术节省了近20倍的支出和时间。

联川Oligomix®早已被研究人员成功应用于基因合成,文库构建,新药发现,以及靶向捕获探针制备等诸多应用领域。


OligoMix®成功扮演CRISPR的Guide RNAs

在CRISPR-Cas9突变筛选中,研究人员需要将能够靶向成千上万个基因位点的guide RNAs克隆到病毒载体中,然后“投递”到靶向细胞中。通过鉴定guide RNAs在设定表型细胞中的富集情况,研究人员能够系统并快速地鉴定与特定表型相关的基因。为了使大规模筛选试验成为可能,就需要大规模合成guide RNAs。

OligoMix®正为那些希望大规模合成guide RNAs文库的研究人员提供了一套独一无二的解决方案。研究人员可以快速合成包含数千条完全定制化的序列文库,这些特异性单链寡核苷酸序列可识别基因组中特定的区域。

下面举几个OligoMix®作为CRISPR Guide RNAs的成功应用案例

Nat Biotechnol (2016) High throughput mapping of regulatory DNA.(IF=41.514)


 
图2 MERA实验方案

来自MIT(Gifford实验室)和Brigham and Women’s Hospital的研究人员证实,OligoMix®合成的guide RNAs文库在MERA技术中具备有效性。MERA技术全称是Multiplexed Editing Regulatory Assay,即基于CRISPR-Cas9的多重基因编辑调控实验的筛选方法。

Genome Res (2016) A new class of temporarily phenotypic enhancers identified by CRISPR/Cas9-mediated genetic screening.(IF=14.630)


 
图3 鉴定顺式调控元件的高通量CRISPR/Cas9介导筛选方案

Ludwig Institute for Cancer Research任兵教授团队以Oligomix®作为Guide RNAs,成功开发出一种基于CRISPR/Cas9基因组编辑的高通量筛选技术,可用于功能性筛选人类基因组中的顺式调控元件。研究团队将这一策略用于人类胚胎干细胞中POU5F1基因上,不仅揭示出一些经典的顺式调控元件,还发现一类非常规的调控元件。这些非常规的调控元件能够以一种意想不到的方式进行转录调控。

Methods Enzymol (2014) Adapting CRISPR/Cas9 for functional genomics screens.


 
图4 sgRNA文库合成与混合筛选策略

McGill University研究人员证实将寡核苷酸库(Oligomix®)克隆到逆转录病毒表达载体,可同时传递Cas9核酸酶和sgRNAs。这种方法为高通量功能基因组筛选提供了稳定和可重复性表达的基因编辑工具。

更多OligoMix®在CRISPR-Cas9中的前沿应用等你来实现!

参考文献
1.Gao X, Church, GM, et al. (2004) Accurate multiplex gene synthesis from programmable DNA chips. Nature 432,1050-1054.
2.Rajagopal N, Srinivasan S, Kooshesh K, Guo Y, Edwards MD, Banerjee B, Syed T, Emons BJ, Gifford DK, Sherwood RI (2016) High throughput mapping of regulatory DNA. Nat Biotechnol 34(2):167-74.
3.Diao Y, Li B, Meng Z, Jung I, Lee AY, Dixon J, Maliskova L, Guan KL, Shen Y, Ren B.(2016) A new class of temporarily phenotypic enhancers identified by CRISPR/Cas9-mediated genetic screening. Genome Res 26(3):397-405.
4.Malina A, Katigbak A, Cencic R, Maïga RI, Robert F, Miura H, Pelletier J. (2014) Adapting CRISPR/Cas9 for functional genomics screens. Methods Enzymol546:193-213.

联川生物为CRISPR研究人员提供大规模高性价比Guide RNA文库合成服务

获取更多用户研究案例,请关注联川微信公众号或拨打0571-87662413。


 
关于联川生物
联川生物成立于2006年,经过多年的快速发展,已成为业界领先的多组学技术服务商。公司拥有具有自主知识产权的µParaflo®微流体定制化芯片平台,可以为科研用户提供从基因组,转录组,到蛋白组的高通量定制化表达谱芯片解决方案。我们是全球首家提供microRNA表达谱芯片分析的服务商。作为国内最早提供高通量测序技术服务的公司之一,联川生物拥有经验丰富的技术团队和一流的生物信息学专家组,可以为研究人员提供多组学测序服务和深度个性化数据分析解决方案。为满足研究人员跨组学高通量研究需求,联川生物已将蛋白质组定量分析引入技术服务线,为用户提供贯穿中心法则的全程解决方案。多年来,联川生物一直与国内的科研团队保持着长期紧密的合作,助力科研人员在生物、医学、和农林领域的科学发现。全球科研用户使用联川生物的优质科研服务和高质量组学实验数据已发表了逾600篇高水平研究论文,其中已在Cell,Nature,Science系列顶级期刊上发表论文22篇。

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