追赶微生物组的热潮,你准备好了吗?(上)[创新技巧]

【字体: 时间:2015年04月02日 来源:生物通

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  有了新型的测序仪,人们开始着手研究健康的人体中生活着哪些类型的微生物。当然,同样是健康的人,你和我的微生物群落就大不相同,就算同一个人,不同部位的微生物也大相径庭。这种差异性使得人们难以描述“正常的”微生物组。于是,研究人员从数百名个体中采样,提取信息。他们关注各个部位,包括口腔、皮肤、鼻腔、肠道,以及泌尿生殖道。

也许你并没有意识到,你身边最亲密的小伙伴其实是微生物。这些小家伙无处不在:土壤中、水中,甚至是我们的身体中。不管你是否愿意,反正它们是挺乐意和你在一起的。皮肤上、口腔内、肠道中,到处都有它们的身影。它们的数量远远超过人体细胞。

美国遗传学家、诺贝尔奖得主Joshua Lederberg用microbiota这个词来表示微生物的集合,强调了栖息在人体中的微生物对于健康和疾病的重要性。之后,有些人也使用microbiome来表示群落中的所有微生物。这两个词基本同义,不过许多文章倾向于使用microbiome来形容群落中微生物的基因组,而microbiota侧重于微生物本身。

说到微生物研究的历史,相信大家还能回忆起列文虎克这个名字。17世纪,这位荷兰人用他的显微镜首次观察到人体口腔内的细菌。之后,人们一直在研究这些神秘的小家伙。他们从病人身上采样,在实验室中培养,并利用显微镜和染色技术来研究。这种方法很适合那些容易培养的微生物,比如大肠杆菌,但大多数微生物无法培养,也就一直披着神秘的面纱。直到近几年,新一代测序技术的蓬勃发展,让微生物组的研究展现曙光。

亲密无间的小伙伴

工具在手,说走就走。有了新型的测序仪,人们开始着手研究健康的人体中生活着哪些类型的微生物。当然,同样是健康的人,你和我的微生物群落就大不相同,就算同一个人,不同部位的微生物也大相径庭。这种差异性使得人们难以描述“正常的”微生物组。于是,研究人员从数百名个体中采样,提取信息。他们关注各个部位,包括口腔、皮肤、鼻腔、肠道,以及泌尿生殖道。

肠道菌群是个很早就有的概念。尽管人们还不大了解,但补充益生菌的说法由来已久。于是,研究人员也对各类人群的肠道微生物组进行了探索,包括老人、儿童、孕妇。对于一些代谢方面的疾?。ㄈ缣悄虿。?,细菌自然脱不开干系。因此,微生物组的研究不仅有助于疾病的诊断和治疗,还能帮助科学减肥。根据Cell Metabolism上的最新成果,8-12小时限制进食比时不时吃点东西要好得多,虽然这挺难做到的。

在人类皮肤上,细菌、真菌和病毒组成了一个复杂的生态系统。真菌生长慢而且难于培养,这大大影响了相关皮肤病的诊断和治疗。2013年,美国国立卫生研究院(NIH)研究人员首次解析了人类皮肤上的真菌多样性。他们对健康人不同皮肤部位的真菌DNA进行了测序,明确了皮肤上正常真菌群落的构成,为研究真菌类皮肤病打下了基础。

甚至连胎儿,也不是生长在无菌的环境中。去年发表的一项研究表明,在健康孕妇的胎盘中,生活着小规模却多样化的细菌群落,这完全颠覆了传统的观点。之前,人们一直认为子宫是人体内的一个无菌部分,而研究结果表明微生物可能在胎儿发育过程中就已经发挥作用。

眼看着微生物组的研究如火如荼地开展,也许你也有点心动。那么,我们该如何动手,了解这些小伙伴是谁?它们在干什么?

它们是谁?

宏基因组学包括两种不同的测序策略。靶向宏基因组学关注特定的基因序列,通常是16S核糖体RNA基因,它提供了系统发育的“条形码”,可用来调查群落的组成。而鸟枪法宏基因组学则对一切测序,这不仅仅了解哪些微生物存在,还研究它们的潜在功能。


16S核糖体RNA(rRNA)中的序列变异被广泛用于微生物群体中分类多样性的鉴定。16S序列由9个可变区组成,中间穿插着保守区。多种生物的16S rRNA基因及其可变区序列已经确定,在多个数据库中可查到,如Greengenes和Ribosomal Database Project。利用这种标记,研究人员能够鉴定微生物,而不用对整个基因组测序,显著降低了测序成本。

根据Illumina发布的应用指南“16S Metagenomics Studies with the MiSeq System”,这个流程包括DNA分离、文库制备、测序以及数据分析。通过一个或多个可变区的测序,研究人员能够快速高效地分析复杂的微生物样品,监测细菌群体的波动。

一开始当然是采集样品,之后可利用专门的试剂盒分离DNA。Illumina提供了SoilMaster DNA Extraction Kit和ExtractMaster Fecal DNA Extraction Kit,可分别从环境样品和粪便样品中提取DNA。在去污剂裂解过程之后,通过层析去除与DNA共同提取出的小分子抑制剂。之后可立即开展PCR。Meta-G-Nome DNA Isolation Kit则适用于水、土壤和堆肥样品中难以培养的物种。

QIAGEN的QIAamp DNA Stool Mini Kit也适合这方面的研究。它应用硅胶膜技术从新鲜或冷冻的人类粪便或其他含有高浓度PCR抑制剂的样品类型中纯化多达30 μg的基因组DNA、细菌、病毒或寄生虫DNA。独特的吸附树脂InhibitEX配合经优化的缓冲液可去除PCR抑制剂。

接着便是文库制备。利用特异的引物,通过PCR扩增16S rRNA的可变区,添加测序接头和索引。之后将扩增子合并成单个文库,在测序系统上进行测序。MiSeq系统是个不错的选择。它支持2 x 300 bp的读长,产量达15 Gb。簇生成和双端测序自动开展,无需用户干预。

最后是数据分析,将多条序列根据其序列之间的距离对它们进行聚类。那些序列相似性在97%以上的序列可聚类成操作分类单元(OTU),被认为可能属于属。人类生殖道样品大约有2千个OTU,而人类肠道则有4万个OTU。当然,目前也有一些工具能协助深度的数据分析。

据Illumina介绍,数据分析可在MiSeq系统上进行,也可在BaseSpace中进行。MiSeq Reporter软件能够在测序仪或独立的计算机上分析数据,提供了每个样品序列的分类?;蛘?,数据可转移到BaseSpace中,分析、存储并与合作者共享。BaseSpace最快能在12小时内提供分析好的序列。

然而,16S扩增子测序的方法也存在一定的缺陷,如PCR和克隆偏向。引物经过设计,与保守区域杂交,但这些区域可能在漫长的进化周期内发生改变,让探针的杂交丧失。这将有可能低估进化上遥远的群体成员。而可变区的大小各异,以不同的速率发生变化,例如V6标签似乎系统地高估了物种丰富度。(未完,待续)

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